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TEM離體細胞的取材與固定

更新時間:2017-04-23 點擊數:3961

離體細胞包括培養細胞、脫落細胞、細菌、精子、卵子和 血液細胞等,散在不同介質中,取材關鍵是:使細胞完好無損的從介質中分離出來,并形成細胞團塊。如果富集的細胞團塊較大,必須分割成約1.5 mm3的小塊。離體細胞取材與固定方法主要有:離心沉淀法、原位固定法等,視不同研究目的而定。取材前,應根據不同種類培養細胞及其研究目的,選擇合適的取材時間點,確保使培養細胞存活狀態符合研究目的,要求細胞數量106,同時應檢測、調整緩沖液與24% 固定液的pH細胞培養液的pH相同,并且溫度接近。剛從4 ℃冰箱取出的緩沖液和固定液不能直接注入培養細胞。

A.懸浮培養細胞取材與固定 

(1)全細胞懸液置入潔凈離心管;

(2)1 000 r/min低速離心5 min,使離心管底部形成細胞團;

(3)棄去上清液,加入緩沖液,選擇合適的離心速率和時間,如采用5 000 r/min,離心10 min,至出現致密貼壁的細胞團塊、用牙簽挑起不散;

(4)棄去上清液,注入2%4%戊二醛(或多聚甲醛和戊二 醛混合固定液),即可送專業實驗室進入后續制備。

注意:當用牙簽挑起細胞團塊時,若細胞呈分散狀,最好在離心管中注入5 μL左右血清或抗凝血漿蛋清亦可,充分混合后再次離心,直至管底部出現致密貼壁細胞團塊。為提高細胞固定效果,也可以先在細胞培養液中加入等量2%4%戊二醛固定液或混合固定液,固定 1 min之后離心成團。

B.貼壁培養細胞取材與固定 

依據研究目的和要求不同,貼壁培養細取材有3種方法。 一是“先離心后固定”,即:棄去培養液,加入等溫的緩沖液,用細胞劃片刮取細胞,作細胞懸液,參照上述懸浮細胞取材步驟操作。二是“先固定、后離心”,即:棄去一半或分部培養液,快速加入適量等溫的醛類固定液,固定1min左右,刮起細胞細胞懸液。三是“原位固定、倒扣包埋”。

注意:每種細胞(包括細菌)大小不同,其最佳離心富集速率和時間不同,一般參考值為:5 000 r/min,5 ~10min。太高離心轉速和離心時間會造成細胞擠壓、變形等;而太低的轉速往往不能一次離心成團,長時間反復離心同樣傷細胞。應充分檢索文獻并確認取材細胞適宜的富集速率、時間再著手實驗,避免損傷細胞。

C.極少的離體細胞取材與固定

對于極少的離體細胞<104,如脫落細胞等,收集細胞有一定難度,可采用尖底離心管或自制模具,注入血清或抗凝血漿,與細胞充分混合后離心。

D.卵母細胞和受精卵細胞的取材與固定

雖然卵母細胞和受精卵細胞體積很大,但每枚卵細胞在緩沖液中都是透明的,且數量少,肉眼難以觀察。為形成可視的細胞團塊,取材時可選擇其他培養細胞,如顆粒細胞等與卵細胞混合離心,卵細胞包被在非卵細胞之中,再按上述方法處理。

E.血細胞的取材與固定

首先要解決血液凝固問題,加入肝素、檸檬酸鈉或EDTA等抗凝劑,阻止血小板與纖維蛋白結合,例如 采用3.8%檸檬酸鈉,當抗凝劑與血液的比例為1 9時,血液不會凝固。然后,抗凝全血以1 000 r/min、15 min離心,離心管抗凝血液便析出三層細胞,底部紅色的紅細胞,中間層白色的白細胞和血小板,最上層透明的是血漿,用毛細吸管緩慢吸取上清液,再用毛細吸管緩慢吸取所需要的細胞,按上述方法離心沉淀形成緊密細胞團塊。

外地課題組寄送樣品,請注意參考:5.寄送電鏡樣品注意事項

 


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